生物打印是一种可以快速精确地实现细胞空间定位的新兴技术。这一技术为生物化学研究带来了无数的机会，例如用于治疗修复的工程组织和用于药物筛选的体外模型。但是少有生物墨水能够完全满足挤出式3D打印的需求，包括良好的可打印性，较高的结构保真度和良好的生物相容性。近日，一篇名为“Aninjectablebioinkwithrapidprototypingintheairandin-situmildpolymerizationfor3Dbioprinting”的文章由中国人民大学的王亚培教授研究团队在生物制造和生物材料顶级期刊Biofabrication(IF=10.02)上发表。该研究展示了一种基于明胶、细菌纤维素(BC)和微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG酶)的复合生物墨水，它具有出色的可打印性和持久的结构完整性。利用3D打印构建的水凝胶细胞载体可以在体外为细胞提供有利的生化环境，支持细胞生长和增殖。同时体内研究也表明，该复合生物墨水具有优良的生物相容性和生物降解性。这种新型复合生物墨水或许将推动生物3D打印技术的进一步发展。
背景介绍
生物3D打印技术满足了对活细胞的精确空间定位要求，使得重建三维组织和器官复杂生理微环境成为可能。在各种生物打印策略中，挤出式生物3D打印由于其相对较低的成本和多功能性已成为最为广泛研究的技术之一。尽管已有很多研究来提高挤出式生物3D打印技术的可重复性和可靠性，但是现有生物墨水仍然存在几个关键的挑战:(1)与挤出过程相适应的流变性，即可打印性;(2)快速的固化过程以获得高结构保真度;(3)温和的固化过程以保护细胞;(4)足够的机械强度以获得生理结构所需的稳定性。众多天然大分子中，明胶因其优异的生物相容性、生物降解性和非免疫原性而成为生物墨水的经典组分。然而，由于明胶固有的低粘度和在生理条件下的不稳定性，使其无法直接打印并长期具有高保真度。如何将明胶转化为生物墨水，使其具有适当的流变性，温和的固化过程，体温条件下稳定而不损害其生物相容性是生物3D打印领域的一个难题。
剪切变稀通常被认为是生物墨水的理想特性，可以通过改变聚合物浓度或引入与聚合物链有亲和力的纳米粒子(如粘土纳米片/硅酸盐纳米片)来调节。细菌纤维素(BC)是醋酸杆菌属细菌产生的胞外多糖。由于其固有的生物相容性好，拉伸强度高，兼具良好的纤维网络和高结晶度，细菌纤维素(BC)被用作改变明胶溶液的流变性的辅助材料，使明胶生物墨水在无需冷却系统辅助的情况下，可以在32℃以上的温度下挤出，并具有较高的结构保真度。另外，细菌纤维素(BC)与细胞外间质相似，可以有效地提高细胞亲和力。但是，在37℃的生理环境中，明胶物理交联性差，不能提供机械稳定性，因此仍需采用温和的化学固化策略。微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG酶)作为交联剂用于交联豆腐或交联牛肉丸中的大豆蛋白，以增加韧性。它在聚合物链之间提供分子内和分子间的共价结合点，过程温和，催化特定位置的键合并保证功能基团不改变。
结合细菌纤维素(BC)和微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG酶)的优点，该研究提出了一种新的复合生物墨水用于生物3D打印，直接挤出载细胞明胶基结构，具有高的结构保真度和生理环境中的机械稳定性，有望用于体外组织模型和体内组织再生辅助剂。
图1.(a)剪切变稀水凝胶的打印和原位酶交联过程。(b)微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG)催化凝胶过程的机理。
实验过程与结果
1.复合生物墨水的流变特性
可打印性是生物3D打印技术的关键影响因素之一，为了满足适当的流变性能要求，将细菌纤维素(BC)选作流变学改进剂，将明胶溶液转化为可注射的复合生物墨水。如图2(a)所示，明胶、细菌纤维素(BC)和复合生物墨水分别挤出在垂直的载玻片上。复合生物墨水可以在载玻片上保持固着液滴的形状，而另外两组液滴则迅速向下流动，无法维持其原有形状。剪切变稀的特征允许混合生物墨水直接打印在玻璃基板上(图2(b))。如图2(c)和(d)所示，复合生物墨水从喷嘴挤出后可以保持柱状，而纯的明胶溶液由于表面张力会很快地收缩。从流变测试看，明胶的粘度随着剪切速率的增加而保持恒定，而细菌纤维素(BC)的加入使复合生物墨水具有明显的剪切变稀行为(图2(e))。此外，类固体生物墨水表现出屈服应力行为，这有利于三维打印过程。
图2.(a)明胶(20wt%)，细菌纤维素(0.65wt%)和复合生物墨水(20wt%明胶+0.65wt%细菌纤维素)挤出在垂直玻璃载片上的照片。(b)复合生物墨水挤出示意图(左)及照片(右)。比例尺:1cm。(c)、(d)明胶与复合生物墨水的可打印性比较。(e)混入不同浓度细菌纤维素所得生物墨水(20wt%明胶)粘度与剪切速率的关系。(f)不同应力作用下，复合生物墨水的储能模量和损耗模量曲线。(g)混入不同浓度细菌纤维素所得生物墨水(20wt%明胶)的屈服应力。
2.复合生物墨水在生理条件下的稳定性
该研究中，微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG酶)可以催化蛋白质链之间共价键的形成化学交联。如图3(a)所示，现有两种类型的锦鲤鱼形水凝胶，不加酶的明胶水凝胶在室温下稳定，在生理温度下融化。但是另外一组中，酶的催化交联作用可以让水凝胶在生理温度下仍能保持成形结构。此外如图3(b)所示，增加酶的浓度可以缩短固化时间。流变学数据在图3(c)定量表征了酶催化交联过程，即随着时间的推移，储能模量逐渐增。凝胶复合材料的力学性能可以通过调节明胶和细菌纤维素(BC)的用量来调节，如图3(e)所示。
图3.(a)内部不含微生物谷氨酰胺转胺酶和内部含酶的锦鲤鱼形水凝胶结构在室温与生理温度下的形状。(b)不同浓度的酶固化复合生物墨水所用时长。(c)20min固化过程中复合生物墨水储能模量的变化趋势。(d)复合生物墨水与0.2g/ml谷氨酰胺转胺酶形成的水凝胶在冻干后的扫描电镜图。(e)含不同质量分数细菌纤维素的水凝胶储存模量变化(0.2g/ml谷氨酰胺转胺酶)。(f)含不同质量分数细菌纤维素的水凝胶的应力-应变曲线。(g)含不同质量分数细菌纤维素的水凝胶(20wt%明胶)杨氏模量。
3.可用于复杂水凝胶结构的打印
基于流变学研究，复合生物墨水可被用于3D打印。所有的3D打印实验均由上普的BioMaker打印机完成。设计的3D模型和打印的3D结构(耳朵和半月板结构)之间的比较证明了生物墨水的高打印保真度(图4(a)和(b))。碗状结构打印进一步证明了复合生物墨水的自支撑性能，如图4(f)和(g)所示。
图4.利用复合生物墨水打印可得各种三维结构。(a)耳朵形状和(b)半月板形状的俯视图。(c)耳朵形状和(d)半月板形状的侧视图。(e)网格结构的俯视图和放大视图。(f)、(g)碗状水凝胶结构。(h)网格结构的侧视图。比例尺:1cm。
4.体外细胞相容性评价
通过细胞增殖、细胞迁移和细胞活性评价了复合明胶生物墨水的细胞相容性。选用大鼠动脉内皮细胞(RAOEC)细胞、正常肝细胞(LO2)进行细胞相容性评价。如图5(a)所示，细胞在水凝胶表面生长良好且有伸展现象。此外，包裹在水凝胶中的细胞在凝胶化后仍然保持高活性(图5(b))。随后用CCK-8法对水凝胶样品进行了细胞毒性测定，如图5(g)和(h)所示，含有不同量明胶或微生物谷氨酰胺转胺酶(mTG酶)的水凝胶的细胞活力超过%。据推测，该复合墨水完全由生物大分子组成，这些生物大分子不仅具有良好的生物相容性，而且具有促进细胞增殖的潜力。
图5.(a)在水凝胶表面培养大鼠动脉内皮细胞。(b)在水凝胶内包裹人肝正常细胞。3D打印水凝胶结构体在体外培养(c)1、(d)3、(f)7天后的活死染色图像(e)为(d)的放大图像。(比例尺:微米)；(g)含有不同质量分数明胶的水凝胶(0.65wt%细菌纤维素+0.2g/ml谷氨酰胺转胺酶)的细胞活性测试结果(n=4)。(h)含不同浓度谷氨酰胺转胺酶的水凝胶(20wt%明胶+0.65wt%细菌纤维素)的细胞活性测试结果(n=4)。
5.体内生物相容性
除了细胞相容性，体内生物相容性和降解性对于水凝胶的植入同样很重要。因此，通过体内植入实验评价了复合生物墨水和酶固化水凝胶的相容性和降解性。图6(a)是皮下植入过程的示意图。所有动物在实验期间均保持存活，没有明显的恶性肿瘤，感染或脓肿(图6(c)-(f))。HE染色的组织切片显示皮肤结构完整，注射后未发现表皮或真皮改变。固化后的水凝胶在植入后三个月后降解，如图6(k)所示。此外，病理切片结果表明，水凝胶的降解产物也是无毒的，不会激活免疫应答。
图6.(a)皮下植入过程示意。(b)植入小鼠体内的位置。(c)-(f)手术后7天、14天、28天和60天植入部位的照片，虚线表示水凝胶所在区域。比例尺:1cm。(g)-(j)利用苏木精-伊红染色表征水凝胶植入后7天、14天、28天和60天的组织切面情况。星号代表植入的水凝胶区域。比例尺:μm。(k)90天后植入的水凝胶在体内的图像。比例尺:1cm。利用苏木精-伊红染色表征(1)水凝胶、(m)对照组(无植入物)和(n)皮下注射PBS组植入90天后组织切面情况。比例尺:μm。
结论
该研究研发了一种新的基于明胶的复合生物墨水，能够直接用于生物3D打印含细胞的水凝胶结构，具有高结构保真度、可调节的机械性能和良好的生物相容性。体外研究表明，该水凝胶的三维结构有利于细胞粘附，细胞迁移和细胞增殖。植入实验证实了该水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性。未来的工作可能会进一步研究生物墨水与不同细胞(如软骨细胞、诱导多能干细胞等)的相互作用，探索其在组织工程中的潜在功能。
参考文献
ZhouY,LiaoS,ChuY,etal.Aninjectablebioinkwithrapidprototypingintheairandin-situmildpolymerizationfor3Dbioprinting[J].Biofabrication,,13(4):.